這是最早用于性病診斷的重組DNA技術(shù)?；驹硎蔷哂幸欢ㄍ葱缘膬蓷l核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。待測核酸序列為性病病原體基因組或質(zhì)粒DNA。探針以放射核素或非放射性核素標(biāo)記，以利于雜交信號的檢測。

所謂雜交（hydridization）指兩個以上的分子因具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體（hybrid），雜交體中的分子不是來自一個二聚體分子。同一個二聚體中的兩個分子在變性解離后重組合稱為復(fù)性。利用兩條不同來源的多核苷酸鏈之間的互補性而使它們形成雜交體雙鏈叫核酸雜交。與核酸雜交技術(shù)相對應(yīng)的另一項技術(shù)被稱為探針技術(shù)，它是指利用標(biāo)記分子對其它分子的識別性而實現(xiàn)對后者進行檢測的一種技術(shù)，我們把標(biāo)記的分子叫探針（Probe）。將探針技術(shù)與分子雜交技術(shù)相結(jié)合，從而使分子雜交技術(shù)得以廣泛推廣應(yīng)用。目前所用的核酸雜交技術(shù)均應(yīng)用了標(biāo)記技術(shù)。

（一）DNA的變性

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團，稱為DNA變性。加熱、改變DNA溶液中的pH，或有機溶劑等理化因素的影響，均可使DNA變性。變性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。

（二）DNA復(fù)性

變性DNA只要消除變性條件，二條互補鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。

核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價健的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間，由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進行分子雜交時，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。使單鏈聚合成雙鏈過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。

（三）探針——靶分子反應(yīng)

從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并與特異靶分子反應(yīng)?？贵w——抗體、外源凝集素——碳水化合物、親合素——生物素、受體——配基（Ligand）以及互補核酸間的雜交均屬于探針——靶分子反應(yīng)，蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水離子和氫鍵）的作用在少數(shù)特異位點上的結(jié)合，而核酸探針與互補鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵幾十、幾百甚至上千個位點上的結(jié)合。這就決定它的特異性。

基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類。DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。

一、核酸探針的種類

（一）DNA探針

DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲的DNA探針種類很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針，這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類ALU探針，這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比用G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向，加之分子雜交技術(shù)的高度敏感性，分子雜交在臨床性病病原體診斷上具有廣泛的前景。

DNA探針（包括cDNA探針）有三大優(yōu)點：第一，這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。其次，DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。第三，DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移法、隨機引物法、PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。

（二）cDNA探針

cDNA是指互補于mRNA的DNA分子（complementary DNA）。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進而整合入宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時復(fù)制，這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達，故無毒性，一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制。如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶也已商品化。最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核mRNA3′末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補于mRNA的cDNA鏈，然后再用RNase H將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。

所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭(Adapter),再經(jīng)特定限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補末端的載體進行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt、EMBL和Charon 系列等。用這類載體可以得到包含105以上轉(zhuǎn)化子文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達的檢測。